Élimination de la méthicilline

Military Medical Research volume 10, Article number: 21 (2023) Citer cet article

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Le traitement des infections du biofilm de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) dans la chirurgie de pose d'implants est limité par le manque d'activité antimicrobienne des implants en titane (Ti). Il est nécessaire d'explorer des approches plus efficaces pour le traitement des infections par biofilm à SARM.

Ici, une stratégie de fonctionnalisation interfaciale est proposée par l'intégration de nanoparticules mésoporeuses de polydopamine (PDA), d'oxyde nitrique (NO) libérant du nitroprussiate de sodium donneur (SNP) et du peptide de croissance ostéogénique (OGP) sur des implants Ti, désignés par Ti-PDA@SNP-OGP. Les propriétés physiques et chimiques de Ti-PDA @ SNP-OGP ont été évaluées par microscopie électronique à balayage, spectroscope photoélectronique à rayons X, angle de contact avec l'eau, propriété photothermique et comportement de libération de NO. L'effet antibactérien synergique et l'élimination des biofilms de SARM ont été évalués par la sonde de diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine, le dosage de la 1-N-phénylnaphtylamine, l'intensité de l'adénosine triphosphate, l'activité d'hydrolyse de l'o-nitrophényl-β-d-galactopyranoside, la fuite d'acide bicinchoninique. La coloration par fluorescence, les tests d'activité de la phosphatase alcaline, la sécrétion de collagène et la minéralisation de la matrice extracellulaire, la transcription inverse quantitative en temps réel et la réaction en chaîne de la polymérase et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ont été utilisés pour évaluer la réponse inflammatoire et la capacité ostéogénique dans les cellules stromales de la moelle osseuse (MSC), les cellules RAW264.7 et leur système de co-culture. La coloration au Giemsa, l'ELISA, la micro-CT, l'hématoxyline et l'éosine, le trichrome de Masson et la coloration immunohistochimique ont été utilisés pour évaluer l'éradication des biofilms de SARM, l'inhibition de la réponse inflammatoire et la promotion de l'ostéointégration de Ti-PDA@SNP-OGP in vivo.

Ti-PDA@SNP-OGP a montré un effet antibactérien synergique photothermique et dépendant du NO contre le SARM suite à une irradiation à la lumière proche infrarouge, et a efficacement éliminé les biofilms de SARM formés en induisant un stress oxydatif médié par les espèces réactives de l'oxygène (ROS), détruisant l'intégrité de la membrane bactérienne et provoquant une fuite de composants intracellulaires (P < 0,01). Des expériences in vitro ont révélé que Ti-PDA @ SNP-OGP facilitait non seulement la différenciation ostéogénique des MSC, mais favorisait également la polarisation des macrophages pro-inflammatoires M1 vers le phénotype anti-inflammatoire M2 (P <0, 05 ou P <0, 01). Le microenvironnement ostéo-immunitaire favorable a encore facilité l'ostéogenèse des MSC et l'anti-inflammation des cellules RAW264.7 via plusieurs voies de signalisation paracrine (P < 0,01). L'évaluation in vivo a confirmé les résultats susmentionnés et a révélé que Ti-PDA@SNP-OGP induisait une amélioration de l'ostéointégration dans un modèle d'implantation de défaut fémoral infecté par le SARM (P < 0,01).

Ces résultats suggèrent que Ti-PDA@SNP-OGP est un matériau multifonctionnel prometteur pour le traitement hautement efficace des infections à SARM dans les chirurgies de remplacement d'implants.

L'infection associée aux biomatériaux (IAB) est un fardeau mondial pour la santé qui est responsable d'environ 40 % de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis [1]. Les infections surviennent tout au long de la durée de vie des implants, mais pas seulement pendant le processus d'implantation, ce qui entraîne inévitablement la défaillance des implants en titane (Ti) [2, 3]. La formation de biofilms de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) sur les surfaces des implants en Ti exacerbe le fardeau du BAI [4]. Les substances polymères extracellulaires (EPS) sont présentées dans la matrice sécrétée par le SARM, qui peut protéger les bactéries intramembraneuses du système immunitaire de l'hôte et des défis environnementaux externes tels que la perméation des antibiotiques et la pression environnementale [5, 6]. Le retrait et le remplacement des implants infectés est souvent le choix de Hobson dans la gestion des infections à SARM associées aux implants en raison de l'inefficacité des antibiotiques conventionnels pour éliminer les biofilms de SARM [7, 8]. La capacité d'ostéointégration postopératoire moins qu'idéale des implants en Ti réduit encore leur efficacité [9]. Par conséquent, il est nécessaire de développer une nouvelle stratégie qui élimine simultanément les biofilms de SARM et améliore l'ostéointégration des implants en Ti sans induire de résistance aux médicaments.

La thérapie photothermique (PTT) est une approche non intrusive qui a été largement explorée pour éliminer les biofilms. Cette approche se caractérise par une pénétration profonde des tissus, une adaptabilité de l'application, une sélectivité élevée, de faibles risques de résistance aux médicaments et des effets secondaires minimes [10,11,12]. Les agents photothermiques couramment utilisés comprennent les nanoparticules métalliques (par exemple, les nanoparticules d'or et de cuivre), les molécules organiques (par exemple, la porphyrine, le vert d'indocyanine, les dérivés du thiadiazole), les matériaux à base de carbone (par exemple, l'oxyde de graphène, les nanotubes de carbone, le nitrure de carbone) et les sulfures métalliques (par exemple, le sulfure de cuivre, le sulfure cuivreux, le disulfure de molybdène) [13, 14, 15, 16, 17]. Les nanoparticules de polydopamine (PDA) sont des agents photothermiques prometteurs en raison de leur grande capacité de conversion photothermique, de leur excellente biocompatibilité et de leur possibilité de modification [18,19,20]. Dans une étude précédente, il a été rapporté que des hydrogels composites comprenant du chitosane greffé à l'acide laurique, du polyéthylène glycol modifié par du dibenzaldéhyde et des nanoparticules de PDA chargées de curcumine présentaient une puissante capacité antibactérienne contre les infections des plaies. Cette activité a été attribuée à l'effet synergique entre la lumière proche infrarouge (NIR) déclenchée, la libération à la demande de curcumine ainsi que l'hyperthermie [21]. Cependant, les biofilms n'ont été éradiqués que par l'application d'une irradiation NIR à 70 °C. Bien que le corps humain puisse supporter des températures locales relativement élevées pendant une courte période, les tissus normaux environnants peuvent être endommagés dans des conditions de température élevée [22, 23]. La température douce (~ 5 ° C) induite par le PTT entraîne moins d'effets indésirables, mais les activités antibactériennes et anti-biofilm sont significativement réduites à cette température douce [24, 25]. Pour résoudre ce problème, les scientifiques ont combiné le PTT avec l'application d'agents antibactériens pour l'inhibition de la formation de biofilms et l'élimination des biofilms établis.

La combinaison de la gazothérapie avec le PTT est une approche de bon augure pour améliorer l'efficacité du PTT contre les infections bactériennes, les plaies infectées, l'inflammation, les maladies cardiovasculaires et les cancers [26,27,28]. Le traitement des infections bactériennes par gazothérapie implique l'utilisation d'un volume élevé de molécules gazeuses telles que l'hydrogène, le sulfure d'hydrogène, le monoxyde de carbone, le dioxyde de carbone, le dioxyde de soufre et l'oxyde nitrique (NO) [29,30,31,32,33,34]. Le NO est une molécule gazeuse endogène importante dans les processus physiologiques et pathologiques. L'efficacité antibactérienne du NO est attribuée à son effet néfaste sur les protéines et les molécules d'ADN à des concentrations élevées. Le NO possède une puissante activité antibactérienne contre l'invasion bactérienne chez les mammifères sans provoquer de résistance aux médicaments [35, 36]. Néanmoins, l'utilisation de la gazothérapie pour le traitement des infections bactériennes est limitée par une accumulation insuffisante de gaz au site infecté, un comportement de libération incontrôlé et des mécanismes thérapeutiques imprécis [37, 38]. À ce jour, différentes approches de déclenchement du NO ont été étudiées. Ces approches incluent le glutathion, les enzymes, le pH, le H2O2 et les traitements photothermiques. Parmi eux, le PTT est une approche prometteuse et efficace en raison de sa pénétration tissulaire profonde et de son comportement de libération contrôlable de NO sous irradiation NIR [23]. Par conséquent, il existe un besoin pressant de développer des systèmes d'administration de médicaments stimulés par laser NIR avec un comportement de libération "à la demande" pour améliorer la spécificité de la thérapie par le gaz.

Avec le développement des nanotechnologies, les diazéniumdiolates (NONOates), le N,N′-disecbutyl-N,N′-dinitroso-p-phénylènediamine (BNN6), le S-nitrosoglutathion (GSNO) et la L-arginine (L-Arg) ont été largement utilisés comme donneurs de NO [23, 28]. Cependant, des problèmes tels que la toxicité des sous-produits, une demi-vie courte, une accumulation de gaz insuffisante, un comportement de libération incontrôlé et des mécanismes thérapeutiques imprécis affaiblissent l'efficacité thérapeutique de ces composés in vivo [28]. En comparaison, le nitroprussiate de sodium (SNP) est plus biocompatible que les autres et peut être utilisé comme donneur déclenché par photothermie pour la libération "à la demande" de NO, en raison de sa sensibilité aux températures élevées [39, 40].

Dans cette étude, afin de parvenir à l'éradication des biofilms de SARM et d'améliorer l'ostéointégration, une stratégie multifonctionnelle a été proposée en couplant la thérapie au gaz NO, le PTT avec la thérapie peptidique sur des implants en Ti.

Des tiges de Ti (longueur : 10 mm, diamètre : 15 mm) et des feuilles de Ti (10 mm × 10 mm, 0,25 mm d'épaisseur) ont été obtenues auprès du Northwest Institute for Non-ferrous Metal Research (Xi'an, Chine). Le chlorhydrate de dopamine, le diacétate de fluorescéine, l'iodure de propidium, le Pluronic F-127, le DCFH-DA, l'o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) et le Hoechst 33258 ont été achetés auprès de MilliporeSigma (St. Louis, MO, USA). Le SNP, le tris (hydroxyméthyl) animométhane (Tris), le 1,3,5-triméthylbenzène, la polymyxine B et la N-phényl-1-naphtylamine ont été achetés auprès d'Aladdin Industrial Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8), le bouillon Mueller Hinton (MHB), l'agarose et le paraformaldéhyde ont été obtenus auprès de Solarbio Biotechnology Co. (Beijing, Chine). Kit de dosage de l'acide bicinchoninique (BCA), réactif de Griess, kit de dosage de la lactate déshydrogénase (LDH), kit de coloration BCIP/NBT phosphatase alcaline (ALP), kit de dosage ALP, kit de coloration au rouge Sirius, sel de sodium rouge d'alizarine, kit de dosage de l'adénosine triphosphate (ATP), kit de détection de la 3,3′-diaminobenzidine (DAB), kit de coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE), tri de Masson Le kit de coloration au chrome et le kit de coloration au Giemsa ont été achetés auprès de Beyotime Biotechnology Co. (Jiangsu, Chine). Le peptide de croissance ostéogénique (OGP, ALKRQGRTLYGFGG) a été acheté auprès de Top‐Peptide Co., Ltd. (Shanghai, Chine). La rhodamine-phalloïdine, le réactif Trizol et les amorces ont été achetés chez Invitrogen Co. (CA, USA). Des kits de dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour le facteur de transcription lié à Runt-2 (Runx2), la protéine morphogénétique osseuse-2 (BMP2), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), l'interleukine-6 ​​(IL-6) et l'IL-10 ont été achetés auprès d'ABclonal Biotechnology. Co., Ltd. (Wuhan, Chine). D'autres produits chimiques ont été achetés auprès de Xingguang Chemical Co. (Chongqing, Chine).

Du Pluronic F-127 (0,36 g) et du 1,3,5-triméthylbenzène (0,36 g) ont été mélangés et dissous dans un mélange de H20 (65 ml) et d'éthanol (60 ml). Du tris (90 mg) et du chlorhydrate de dopamine (60 mg) ont été ajoutés et agités pendant 24 h à l'obscurité. La matrice et le PDA ont été éliminés par centrifugation. Le PDA a été lavé trois fois avec le mélange d'éthanol et d'acétone. Les nanoparticules de PDA synthétisées ont été dispersées dans de l'éthanol et stockées à -20 ° C pour une analyse ultérieure.

Des nanoparticules de PDA@SNP ont été préparées en dispersant des nanoparticules de PDA (5 mg) dans de l'éthanol. Une solution de SNP pré-préparée (2,5 mg/ml) a été introduite sous agitation. Le mélange noir a été recueilli par centrifugation (11 000 tr/min, 10 min) après 24 h et les nanoparticules de PDA@SNP ont été rincées avec de l'eau déminéralisée.

Les nanoparticules PDA @ SNP ont été immergées dans un tampon Tris – HCl (10 mmol / L, pH 8, 5) contenant de l'OGP (2 mg / ml) pour assurer l'immobilisation covalente des OGP. Après agitation du mélange pendant 24 h, les nanoparticules de PDA@SNP-OGP ont été collectées et rincées à l'eau déminéralisée. La morphologie de PDA, PDA@SNP et PDA@SNP-OGP a été analysée par microscopie électronique à transmission (TEM, Talos F200S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). La quantité totale d'OGP conjuguée sur les nanoparticules PDA @ SNP a été déterminée par un spectrophotomètre ultraviolet-visible (UV-Vis) (UV-3600, Shimadzu, Japon).

Des feuilles de Ti propres ont été trempées dans une solution de chlorhydrate de dopamine (2 mg/ml) contenant 10 mmol/L de tampon Tris (20 ml, pH 8,5) et incubées pendant 24 h. Des nanoparticules de PDA, PDA @ SNP ou PDA @ SNP-OGP (0, 3 mg) ont ensuite été immobilisées sur un substrat de Ti à travers le revêtement de dopamine. Les échantillons ont été rincés à l'eau déionisée et désignés par Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP. La morphologie, la chimie de surface et les angles de contact avec l'eau (WCA) de ces substrats ont été analysés par microscopie électronique à balayage (SEM, Quattro S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), spectroscope photoélectronique à rayons X (XPS, Empyrean, Pays-Bas) et goniométrie d'angle de contact (SDC-200S, Sindin, Chine), respectivement. L'image en coupe et l'épaisseur du revêtement PDA @ SNP-OGP sur l'implant Ti ont été observées par MEB. La force d'adhérence du revêtement a été étudiée à l'aide d'un testeur de rayures (CSM Instruments, Suisse).

L'effet photothermique des nanoparticules préparées a été évalué à l'aide d'un rayonnement NIR émis par un laser à 808 nm (Mild-River Company, Chine). Les changements de température en temps réel ont été enregistrés à l'aide d'un thermomètre numérique (HH806AU, Omega Engineering, Norwalk, CT, USA). En bref, des nanoparticules de PDA, PDA @ SNP et PDA @ SNP-OGP (0, 5 mg / ml) ont été exposées à un laser à 808 nm (1, 00 W / cm2) pendant 10 min. L'efficacité de conversion photothermique (η), les courbes de chauffage et de refroidissement des nanoparticules PDA, PDA@SNP et PDA@SNP-OGP (0,5 mg/ml) ont été évaluées selon les équations suivantes :

où Tmax est la température maximale induite par les échantillons (nanoparticules PDA, PDA@SNP ou PDA@SNP-OGP), Tmax,water est la température maximale de l'eau, Tsurr est la température ambiante ambiante. Q0 est l'apport d'énergie de fond sans spécimens et calculé à partir de l'Eq. (3). I est la puissance du laser (1 W/cm2), A808 est l'absorbance de l'échantillon (PDA, PDA@SNP et PDA@SNP-OGP nanoparticules) à 808 nm, h est le coefficient de transfert de chaleur, S est la surface du récipient d'échantillon, md est le poids de la solution de nanoparticules PDA, PDA@SNP ou PDA@SNP-OGP, et cd est la capacité calorifique de l'eau.

L'effet photothermique du Ti natif ou du substrat de Ti fonctionnalisé a été évalué à l'aide d'un système d'imagerie thermique infrarouge (système d'image IR E40, FLIR, Wilsonville, OR, USA). Ti a été trempé dans un tampon salin tamponné au phosphate (PBS) (500 μl) et exposé à une irradiation NIR (1, 00 W / cm2, 10 min). Les changements de température de chaque échantillon ont été enregistrés et l'intervalle de temps a été fixé à 30 s. De plus, les changements de température du Ti-PDA@SNP-OGP irradié avec différentes densités de puissance NIR (0,25, 0,50, 1,00 et 1,25 W/cm2) ont été évalués.

Le réactif de Griess a été utilisé pour déterminer le niveau de NO. Ti-PDA@SNP-OGP a été exposé au NIR (1,00 W/cm2) pendant 10 min, suivi de 20 min sans irradiation NIR, et cette procédure a été répétée 5 fois. Le milieu résultant a été traité avec le réactif de Griess (50 ul). La quantité de NO libérée par Ti-PDA@SNP-OGP a été déterminée à 548 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. Les profils de libération cumulés de NO de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP ont également été évalués. La concentration de NO libéré a été calculée à l'aide d'une courbe standard.

Le SARM (ATCC33591) a été utilisé pour évaluer la propriété anti-biofilm. Les échantillons ont été cultivés avec 1 ml de suspension de SARM [1 × 108 unités formant colonies (UFC)/ml] en phase de croissance stationnaire à 37 ° C pendant 3 jours, et le milieu de culture MHB a été remplacé tous les jours. La propriété et le mécanisme anti-biofilm ont été déterminés à l'aide du test sur plaque étalée, de l'examen SEM, de la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), de la perméabilité membranaire, de l'intensité de l'ATP et de l'hydrolyse ONPG avec ou sans irradiation NIR.

Pour l'activité anti-biofilm, les échantillons ont été cultivés avec 1 ml de suspension de SARM (1 × 108 UFC/ml) en phase de croissance stationnaire et incubés à 37 °C pendant 3 jours. Les échantillons ont ensuite été exposés à une irradiation NIR (1,00 W/cm2) pendant 10 min. Les bactéries non attachées ont été détachées en lavant doucement avec du PBS. Un millilitre de PBS stérile a été ajouté à chaque puits et le SARM traité a été retiré des substrats par ultrasons pendant 10 min. La suspension bactérienne a été diluée 10 000 fois avec du PBS stérile. Ensuite, 100 µl de suspension bactérienne diluée ont été étalés sur les plaques de gélose. Les UFC ont été imagées et comptées. Le ratio antibactérien de chaque substrat a été calculé à l'aide de la formule : A = (B – C)/B × 100 % ; où A est le rapport antibactérien, B est l'UFC moyenne du groupe témoin (Ti) et C est l'UFC moyenne du groupe expérimental.

Le biofilm de SARM a été cultivé sur un substrat Ti ou Ti fonctionnalisé avec ou sans irradiation NIR pendant 10 min. Les biofilms ont été décapés par ultrasons pour générer une suspension bactérienne. La suspension a été ajoutée à une plaquette de silicium et fixée pendant une nuit avec du paraformaldéhyde (4 % en poids) à 4 °C. Les échantillons ont été déshydratés avec une série ascendante d'éthanol (25 %, 50 %, 75 % et 100 %) et encore déshydratés avec du tert-butanol pendant 10 min. Les spécimens séchés ont été recouverts d'or par pulvérisation cathodique pour examen SEM.

La génération de ROS dans les différents groupes a été évaluée à l'aide d'une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA). Une suspension de SARM (1 ml, 1 × 106 UFC/ml) a été cultivée sur Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP, avec/sans irradiation laser NIR 808 nm. La suspension bactérienne a été incubée pendant 24 h et traitée avec une solution de DCFH-DA (10 μm). Après incubation des spécimens pendant 30 min, l'intensité de fluorescence a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence (RF5301PC, Shimadzu, Kyoto, Japon) avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 525 nm.

Une méthode de sonde fluorescente 1-N-phénylnaphtylamine (NPN) a été utilisée pour examiner la perméabilité membranaire du SARM. Une suspension de SARM a été obtenue par centrifugation (5000 tr/min, 8 min) et traitée avec la sonde fluorescente NPN (10 μl, 10 μmol/L) pendant 30 min. L'intensité de fluorescence de la solution a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence (longueur d'onde d'excitation 350 nm, longueur d'onde d'émission 420 nm). Une suspension de SARM traitée avec de la polymyxine B a été utilisée comme témoin positif. Les intensités de fluorescence des groupes expérimentaux ont été normalisées à celle du groupe témoin (Ti sans irradiation NIR).

Le test BCA a été réalisé pour étudier la fuite de protéines de SARM après divers traitements. Le SARM (1 ml, 1 × 106 UFC/ml) a été ensemencé sur Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP. Après cela, le milieu de culture a été récupéré et vortexé pendant 20 secondes. Ensuite, le mélange (400 μl) a été prélevé, filtré avec un filtre seringue (0,22 μm). Ensuite, l'échantillon de filtrat (25 μl) a été ajouté au kit de dosage de protéines BCA standard et incubé à 37 ° C avec une agitation douce (200 r/min). Enfin, l'absorbance de la solution obtenue a été déterminée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA). La quantité de fuite de protéines = (la quantité de protéines dans chaque groupe expérimental - la quantité de protéines dans le groupe témoin). Le milieu LB avec Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP sans ajout de SARM a été utilisé comme groupe témoin, et le milieu LB avec Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP avec ajout de SARM a été utilisé comme groupes expérimentaux.

Un kit de dosage de l'ATP a été utilisé pour évaluer l'intensité de l'ATP du SARM dans différentes conditions. Le SARM (1 ml, 1 × 106 UFC/ml) a été ensemencé sur Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP. La moitié des échantillons de chaque groupe ont été exposés à une irradiation NIR tandis que l'autre moitié n'a pas été irradiée. Les intensités d'ATP ont été évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre à fluorescence à 562 nm. L'intensité de fluorescence relative des groupes expérimentaux a été obtenue en normalisant l'intensité de fluorescence à celle du Ti vierge sans irradiation NIR (groupe témoin).

L'hydrolyse de l'ONPG a été réalisée pour évaluer la perméabilité membranaire des bactéries présentées dans les biofilms de SARM. Les biofilms de SARM ont été traités avec/sans irradiation 808 NIR pendant 10 min. Les biofilms cultivés sur les différents substrats ont été récoltés par sonication (10 min) et incubés avec une solution d'ONPG (500 μl, 0,75 mol/L). Les valeurs de densité optique des surnageants ont été déterminées à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA).

Pour l'activité déshydrogénase de la chaîne respiratoire, le SARM (1 ml, 1 × 106 UFC/ml) a été incubé avec Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP avec/sans irradiation laser à 37 °C pendant 12 h. Ensuite, le milieu de culture (250 μl), la solution de glucose (1 ml, 100 mmol/L), le tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane (TRIS) (1 ml, 50 mmol/l, pH = 8,6), la solution de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) à 4 % et le bouillon LB (250 μl) ont été ajoutés dans un tube. Après incubation pendant 6 h, de l'acide sulfurique concentré (50 μl) a été ajouté au mélange ci-dessus pour arrêter la réaction. Ensuite, le produit de réaction enzymatique formé [1,3,5-triphénylformazan (TPF)] a été extrait avec du toluène. Enfin, l'absorbance de la solution obtenue a été déterminée à 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA). L'activité relative de la chaîne respiratoire déshydrogénase (%) a été calculée selon la formule suivante : A = B/C × 100 %. Où A indique l'activité relative de la chaîne respiratoire déshydrogénase ; B est la valeur OD490 moyenne du témoin (Ti sans irradiation NIR); et C est la valeur OD490 moyenne des échantillons expérimentaux.

La fuite des composants intracellulaires en tant qu'indicateur pour l'évaluation de l'intégrité de la membrane chez les bactéries a été mesurée par l'approche OD260. 1 ml de SARM (5 × 108 UFC/ml) a été cultivé avec des substrats Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP. La moitié des échantillons de chaque groupe ont été exposés à une irradiation NIR tandis que l'autre moitié n'a pas été irradiée. Après cela, le mélange a été filtré avec un filtre à seringue (0,22 μm) pour éliminer les bactéries et autres matériaux. Enfin, l'absorbance de la solution obtenue a été déterminée à 260 nm par un spectrophotomètre UV-Vis (UV-3600, Shimadzu, Japon).

Des cellules stromales de moelle osseuse (CSM) ont été isolées des tibias et du fémur de dix rats Sprague-Dawley (SD) (mâles, 100-120 g) comme indiqué précédemment [41, 42, 43]. Les rats SD ont été fournis par l'Université médicale de Chongqing et le numéro de licence de production pour les animaux de laboratoire était SCXK 2022-0010. Le milieu a été changé tous les 2 jours et les CSM du troisième passage ont été utilisées dans les expériences ultérieures. Des cellules RAW264.7 (Army Medical University, Chongqing, Chine) ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose additionné de streptomycine/pénicilline et de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (Hyclone, États-Unis) sous 5 % de CO2 à 37 °C.

Des MSC osseuses (1 × 104 cellules/puits) ou des cellules RAW264.7 (1 × 104 cellules/puits) ont été incubées avec différents substrats pendant 2 jours [20]. Les cellules ont ensuite été lysées avec du Triton X-100 (0,2%) pendant 5 min et traitées avec une solution de rhodamine-phalloïdine pendant une nuit pour la coloration du cytosquelette. Après coloration, les échantillons ont été rincés avec du PBS et les noyaux des cellules MSC ou RAW264.7 ont été colorés avec du Hoechst 33258 (200 μl).

Les changements morphologiques dans les cellules MSC ou RAW264.7 ont été évalués à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser (CLSM; FV3000, Olympus, Tokyo, Japon).

Après incubation pendant 1, 4 ou 7 jours, un mélange de solution de CCK-8 et de milieu de culture (1:9, v/v) a été ajouté aux puits de chaque groupe. Les valeurs de densité optique des surnageants ont été déterminées après incubation pendant 2 h à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique à 450 nm. Les cellules RAW264.7 ont été cultivées sur différents substrats pendant 1, 3 et 5 jours. Le test CCK-8 a été réalisé pour évaluer la prolifération cellulaire.

Les cellules cultivées sur différents substrats pendant 7 jours ont été analysées à l'aide d'un kit ALP. Les MSC osseuses cultivées sur différents substrats ont été colorées avec une solution de rouge Sirius pendant 2 h. Les cellules colorées ont été traitées avec du NaOH pour dissoudre les cristaux rouges. Les valeurs de densité optique des surnageants ont été mesurées à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque spectrophotométrique.

Des MSC supplémentaires ont été incubées pendant 21 jours et colorées au rouge d'alizarine (0, 1%) pour évaluer le niveau de minéralisation de la matrice extracellulaire (ECM).

Les nodules minéraux colorés ont été dissous avec une solution de CH3COOH (10 %) et les valeurs de densité optique des surnageants ont été déterminées à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Les cellules RAW264.7 (5 × 104 cellules/ml) ont été activées en ajoutant une solution de lipopolysaccharide (LPS) (40 ng/ml) dans le milieu pour stimuler la polarisation des macrophages en type M1, suivie d'une co-incubation avec différents substrats. Après 24 h de culture, l'activité anti-inflammatoire a été évaluée sur la base des niveaux d'expression de gènes représentatifs de type M1 [CD86, synthase d'oxyde nitrique inductible (iNOS) et CD11C], de type M2 [CD206, arginase-1 (Arg-1) et CD163], de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et IL-1β) et de cytokines anti-inflammatoires (IL-10 et IL -1ra).

Les cellules MSC osseuses ou RAW264.7 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits avec différents substrats. L'ARN total a été extrait des cellules MSC ou RAW264.7 à l'aide du kit Total RNA (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'ARN a été transcrit de manière inverse en ADN complémentaire à l'aide d'un kit de transcription inverse (Takara, Shiga, Japon). Un système Bio-Rad CFX Manager a été utilisé pour qRT-PCR, et les amorces utilisées sont répertoriées dans le fichier supplémentaire 1 : Tableau S1. Les niveaux relatifs d'expression génique ont été obtenus en normalisant les niveaux d'expression au niveau du gène domestique β-actine.

Les concentrations de TNF-α, IL-1β, IL-10 et IL-6 sécrétées par les cellules RAW264.7 ensemencées sur différents substrats ont été déterminées à l'aide de kits ELISA. Des cellules RAW264.7 (5 × 104 cellules/ml) ont été cultivées sur différents substrats et incubées pendant 3 jours. Les échantillons ont été centrifugés, les surnageants ont été collectés et les concentrations de cytokines ont été déterminées à l'aide de courbes standard.

Une expérience de co-culture Transwell a été réalisée pour évaluer la différenciation ostéogénique des MSC sous l'influence des cellules RAW264.7. Des CSM osseuses (1 × 104 cellules/puits) ont été ensemencées dans la chambre Transwell supérieure (Corning, New York, États-Unis ; taille des pores : 8 μm, diamètre interne : 6,5 mm) et co-cultivées avec des cellules RAW264.7 pendant 24 h [41]. Les CSM qui ont migré à travers la membrane ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde et colorées avec 1 % de réactif cristal violet. Les MSC colorées ont été analysées à l'aide d'un microscope inversé (Zeiss, Jena, Allemagne).

Les cellules RAW264.7 (1 × 104 cellules/puits) ont été cultivées sur du Ti ou un substrat de Ti fonctionnalisé pendant 2 jours. Le milieu conditionné de l'échantillon a été collecté et centrifugé (1000 tr/min, 4 min) pour éliminer les cellules résiduelles. Les MSC ont ensuite été cultivées sur des plaques 24 puits avec ajout du milieu conditionnel (1 ml) de chaque groupe. Le milieu conditionné de l'échantillon a été changé tous les 2 jours. Les cellules ont été traitées avec des réactifs de coloration 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)/nitro bleu tétrazolium (NBT), rouge Sirius et rouge alizarine S à un moment prédéterminé. Les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes liés à l'ostéogenèse (Runx2, BMP2, ALP, OPN et OCN) ont été évalués.

Toutes les expériences animales in vivo ont été menées conformément aux directives institutionnelles et aux réglementations pertinentes pour l'expérimentation animale des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Chongqing et du septième centre médical de l'hôpital général de l'APL, et approuvées par les comités d'éthique animale de l'Université médicale de Chongqing (2021-738) et le septième centre médical de l'hôpital général de l'APL (2021-110). Quarante rats SD (mâles, 200–250 g) ont été fournis par l'Université médicale de Chongqing et utilisés pour la chirurgie d'implantation. Les rats ont été anesthésiés et la zone chirurgicale a été rasée et désinfectée. Un modèle de défaut fémoral infecté par le SARM a été construit avec succès en réalisant un défaut cylindrique (1,5 mm de diamètre) à l'aide d'un foret chirurgical au centre du condyle fémoral en direction de la cavité médullaire. Les sites chirurgicaux ont été suturés après avoir délicatement inséré les implants Ti préparés avec des biofilms de SARM formés dans les défauts osseux. Le site d'implantation a été exposé à une irradiation NIR (1,00 W/cm2) pendant 10 min, et les changements de température en temps réel ont été enregistrés à l'aide d'une caméra thermique.

Les rats ont été sacrifiés pour recueillir les échantillons de fémur 3 jours après l'implantation, et les implants intégrés ont été délicatement retirés. Les implants ont été trempés dans du MHB et soniqués pour éliminer le SARM collé. La suspension bactérienne a été cultivée pendant 12 h, diluée (10 000 fois) et inoculée sur des plaques de gélose MHB. L'efficacité anti-biofilm de chaque échantillon a été étudiée. Les colonies de bactéries sur les plaques ont été évaluées et photographiées après culture à 37 ° C pendant 24 h. Les implants ont été trempés dans du milieu MHB et cultivés pendant 14 h. La turbidité de chaque groupe a été photographiée et le niveau de turbidité a été déterminé. Pendant ce temps, un ELISA a été effectué pour déterminer les concentrations de TNF-α, IL-6, TGF-β et IL-10. En outre, des colorations HE et immunohistochimie (IHC) ont été réalisées à l'aide d'anticorps anti-CD68 et anti-CD206 pour étudier l'effet ostéo-immunomodulateur [42]. Des coupes de tissu osseux ont été déparaffinées, hydratées dans une série décroissante d'éthanol (100 à 50 %), l'antigène récupéré, bloqué pendant 30 min et incubé avec des anticorps primaires (CD86 et CD206) pendant une nuit à 4 °C. Les coupes ont ensuite été traitées avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort correspondants à température ambiante pendant 1 h, puis colorées avec un kit de détection DAB pour la réaction colorée et contre-colorées avec de l'hématoxyline.

Les rats ont été sacrifiés 30 jours après l'implantation pour examiner l'étendue de l'ostéointégration entre les implants et les tissus osseux d'origine. Les analyses ont été effectuées à l'aide de la tomographie micro-calculée (micro-CT ; Viva CT40, SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Suisse), de l'HE et de la coloration au trichrome de Masson. Pour le micro-CT, les fémurs récoltés ont été fixés avec un réactif au formol et incubés pendant 2 jours. Les fémurs traités ont été scannés par micro-CT et analysés comme décrit précédemment [42]. Pour la coloration HE et trichrome de Masson, les implants ont été délicatement retirés des fémurs et colorés. Les spécimens colorés ont été observés à l'aide d'un microscope inversé (Zeiss). La biosécurité a également été évaluée à l'aide d'une analyse biochimique du sang total.

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyennes ± écart type (ET). Les données ont été traitées dans le logiciel Origin (version 8.0) par le test de Tukey via une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) pour l'analyse statistique. La signification statistique a été prédéfinie à α = 0,05.

Comme le montre la figure 1a, le PDA présentait une morphologie sphérique bien dispersée avec un diamètre moyen de (176 ± 12) nm. Les diamètres moyens de PDA @ SNP et PDA @ SNP-OGP ont été légèrement augmentés à (183 ± 18) nm et (196 ± 21) nm après le chargement de la modification SNP et OGP, respectivement. La cartographie élémentaire TEM a montré que le fer (Fe) était uniformément réparti dans PDA @ SNP-OGP (Fig. 1b). La diffusion différentielle de la lumière a montré que la taille de PDA @ SNP-OGP était relativement plus grande que les tailles de PDA et PDA @ SNP (fichier supplémentaire 1 : Fig. S1a), ce qui est cohérent avec les images TEM. Selon les résultats de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), les bandes d'absorption à 1125 et 840 cm−1 ont été attribuées à υ-NH et υ-Ar du cycle benzénique. Les pics d'absorption de PDA@SNP à 2102 et 1885 cm-1 correspondaient à υ-CN (ligands CN axiaux et équatoriaux) et υ-NO, indiquant que le SNP a été chargé avec succès sur PDA. Les bandes υ-CN et υ-NO du SNP, et les bandes υ-NH2 et υ-CONH de l'OGP ont été observées après modification avec l'OGP (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1b). Sur la base de la courbe standard pré-préparée [40], le taux de chargement de SNP de PDA @ SNP était de 8, 92% - en utilisant les spectres de spectroscopie de lumière UV – Vis (Fichier supplémentaire 1: Fig. S1c).

Caractérisation de Ti-PDA@SNP-OGP. a Images en microscopie électronique à transmission (TEM) de nanoparticules PDA, PDA@SNP ou PDA@SNP-OGP. Barre d'échelle = 100 nm. b Cartographies élémentaires des nanoparticules PDA et PDA@SNP-OGP. Barre d'échelle = 100 nm. c Images de microscopie électronique à balayage (MEB) de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP. Barre d'échelle = 1 μm. d Angles de contact avec l'eau (WCA) de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP. e Courbes de chauffage de Ti-PDA@SNP-OGP en utilisant une irradiation NIR avec différentes intensités de puissance. f Courbes de chauffe de Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP avec irradiation NIR (808 nm, 1,00 W/cm2). g Les concentrations cumulées de NO de Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP avec ou sans irradiation NIR (808 nm, 1,00 W/cm2) pendant 10 min. **P < 0,01 ; Titane, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique OGP, NO oxyde nitrique, lumière proche infrarouge NIR

Le SEM a été utilisé pour examiner les morphologies du Ti ou du substrat de Ti fonctionnalisé. Ti avait une surface relativement lisse (Fig. 1c). Les PDA, PDA @ SNP et PDA @ SNP-OGP étaient uniformément répartis sur Ti sans différence évidente de morphologie. Cartographies élémentaires de la distribution de Ti, O, C, N et Fe dans Ti-PDA@SNP-OGP. L'analyse XPS de Ti a identifié des signaux de Ti (88,92 %) et O (11,08 %). Comme pour Ti-PDA@SNP-OGP, trois nouveaux pics (C, N et Fe) ont été identifiés (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1d). Les spectres C 1 s de Ti-PDA@SNP-OGP ont montré que les principaux pics étaient concentrés aux emplacements suivants : C=O (287,7 eV), C−O (286,3 eV), C−N (285,4 eV), C−C (284,6 eV) et C=C (284,1 eV). Deux pics d'O 1 s à 532,9 et 531,0 eV ont été attribués à O−C et O=C. Dans le spectre haute résolution N 1 s de Ti-PDA@SNP-OGP, quatre sous-pics à 399,8, 399,2, 398,9 et 398,2 eV ont été attribués à -NH2, -N=O, -N=C, N-C, respectivement (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1e). Ces résultats sont révélateurs de la modification apportée par OGP sur PDA@SNP-OGP. Le Ti était plus hydrophobe avec un WCA de (60,0 ± 5,6)°. Les WCA de Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP étaient (35,0 ± 4,2)°, (32,4 ± 5,0)° et (37,7 ± 4,8)°, respectivement (Fig. 1d). Il a été montré l'image SEM en coupe d'un revêtement PDA @ SNP-OGP sur Ti. L'épaisseur du revêtement sur Ti variait de 3,7 à 8,3 μm (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2a). La force d'adhérence des revêtements PDA @ SNP-OGP sur Ti a été mesurée à l'aide d'un testeur de rayures (CSM Instruments, Suisse). Les charges critiques (Lc1 et Lc2) de Ti-PDA@SNP-OGP étaient respectivement d'environ 1,14 et 1,26 N (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2b). Les données suggèrent une bonne stabilité mécanique du revêtement PDA @ SNP-OGP après son application sur Ti. Cette observation était cohérente avec le résultat d'une étude précédente [4].

Le système d'imagerie photothermique numérique NIR a été utilisé pour évaluer l'effet photothermique de Ti-PDA@SNP-OGP à différentes intensités de puissance NIR. La température de Ti-PDA@SNP-OGP était de 35,6 °C à 0,25 W/cm2, 41,3 °C à 0,50 W/cm2, 52,3 °C à 1,00 W/cm2 et 62,3 °C à 1,25 W/cm2 après irradiation pendant 10 min (Fig. 1e). Les changements de température ont ensuite été évalués pour le Ti ou le substrat de Ti fonctionnalisé en utilisant la puissance d'irradiation (1,00 W/cm2). La température de Ti est passée de 25,0 à 33,7 °C après irradiation pendant 10 min. Cependant, les températures pour Ti-PDA, Ti-PDA @ SNP et Ti-PDA @ SNP-OGP ont augmenté à 52, 8, 52, 0 et 52, 1 ° C, respectivement (Fig. 1f). L'efficacité de conversion photothermique (η) de Ti-PDA@SNP-OGP s'est avérée être de 20,3 % après exposition à une irradiation NIR (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2c). La morphologie de Ti-PDA@SNP-OGP n'a pas changé après irradiation NIR (1,00 W/cm2, 10 min) (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2d).

Les concentrations cumulées de NO libérées par Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP étaient (15,9 ± 1,2) μmol/L et (15,1 ± 1,1) μmol/L après irradiation NIR après 10 min, respectivement. Cependant, la concentration cumulée de NO libérée par Ti-PDA @ SNP ou Ti-PDA @ SNP-OGP n'a pas augmenté sans irradiation NIR (Fig. 1g). La concentration cumulée de NO libérée par le Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR a été significativement augmentée (P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S2e), atteignant (34,6 ± 2,4) μmol/L après 30 min (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2f), ce qui génère un mode de commutation « marche-arrêt » déclenché par le NIR pour la libération de NO (fichier supplémentaire 1 : Fig. S2g). Cependant, la concentration cumulée de NO libérée par le Ti-PDA@SNP-OGP après incubation pendant 72 h n'était que de (4,9 ± 0,8) μmol/L sans irradiation NIR (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S2h).

Une approche de placage étalé par dilution a été utilisée pour étudier l'inhibition et l'éradication du biofilm de SARM sur un substrat de Ti ou de Ti fonctionnalisé avec ou sans irradiation NIR. Tous les substrats n'ont démontré aucune propriété bactériostatique évidente contre les colonies de SARM sans irradiation NIR. Au contraire, le nombre de colonies de SARM formées sur les plaques de gélose dans Ti-PDA @ SNP ou Ti-PDA @ SNP-OGP a été nettement diminué par rapport à celui de Ti après irradiation NIR (Fig. 2a). Après 10 min d'irradiation NIR, les taux d'élimination des biofilms de SARM par Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP étaient (62,4 ± 7,6) %, (98,7 ± 2,6) % et (97,6 ± 4,7) %, respectivement (Fig. 2b). Sur la base d'images SEM, le SARM présentait une structure membranaire sphérique et intégrée sur Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP sans irradiation NIR. Après irradiation NIR, les biofilms de SARM ont été partiellement détruits dans Ti-PDA, avec des membranes cellulaires flétries et endommagées (indiquées par des flèches rouges). Après irradiation NIR, la morphologie des biofilms de SARM sur Ti était encore lisse et compacte. En revanche, les biofilms de SARM ont été éliminés et la majorité des bactéries étaient mortes avec des marges non focalisables sur Ti-PDA @ SNP ou Ti-PDA @ SNP-OGP (Fig. 2c).

Activité anti-biofilm in vitro de Ti-PDA@SNP-OGP avec ou sans irradiation NIR. un. Images représentatives des colonies de SARM dans des plaques d'agar de chaque groupe avec ou sans irradiation NIR. b Efficacité d'élimination des biofilms de SARM basée sur les résultats des plaques de gélose dans chaque groupe. c Images de microscopie électronique à balayage (SEM) de biofilms de SARM de chaque groupe avec ou sans irradiation NIR. Barre d'échelle = 2 μm. Les flèches rouges indiquent les membranes cellulaires endommagées. d Intensité ROS FL du SARM de chaque groupe par sonde DCFH-DA sous irradiation NIR. e Intensité FL relative de SARM dans diverses conditions par sonde fluorescente NPN, la polymyxine B a été utilisée comme contrôle positif. Les intensités de fluorescence des groupes expérimentaux ont été normalisées à celles du Ti vierge sans irradiation NIR. f Intensité relative de l'ATP du SARM dans chaque groupe mesurée avec un spectrophotomètre à fluorescence. L'intensité de fluorescence relative des groupes expérimentaux a été obtenue en normalisant l'intensité de fluorescence à celle du Ti vierge sans irradiation NIR. g Hydrolyse ONPG du SARM de chaque groupe à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique. **P < 0,01 ; Titane Ti, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique NIR, lumière proche infrarouge SARM, balayage de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, espèces réactives de l'oxygène ROS, DCFH-DA 2′,7′-dichlorofluorescéine diacétate, NPN 1-N-phénylnaphtylamine, fluorescence FL, ATP adénosine triphosphate, ONPG o- nitrophényl-β-D-galactopyranoside

Les biofilms de SARM ont été colorés en violet foncé sur Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP sans irradiation NIR (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3a). Après irradiation NIR, la coloration sur Ti-PDA @ SNP et Ti-PDA @ SNP-OGP est devenue plus brillante et la biomasse du biofilm était de 0, 31 et 0, 37, respectivement ( P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S3b). La biomasse du biofilm a diminué à 68,9 % et 72,3 % après 2 min d'irradiation NIR sur Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP, respectivement. Lorsque les biofilms de SARM ont été irradiés pendant des périodes plus longues (plus de 10 min), la biomasse du biofilm sur Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP a été réduite à 8,1 % et 13,3 %, respectivement (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3c). La capacité anti-biofilm de l'antibiotique vancomycine a ensuite été comparée aux effets obtenus à l'aide de Ti-PDA@SNP-OGP irradié au Ti ou au NIR. La viabilité du SARM de la vancomycine était de 29, 6%, ce qui était significativement plus élevé que celui du Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR (8, 3%) ( P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S3d). De plus, la biomasse relative du biofilm dans le Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR était significativement inférieure (10, 4%) à celle du Ti (100, 0%) et de la vancomycine (95, 6%, P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S3e). Collectivement, ces résultats indiquent que l'hyperthermie et la libération de NO déclenchée par la photothermie par Ti-PDA@SNP-OGP ont affiché un effet antibactérien synergique contre le SARM et pourraient éradiquer efficacement les biofilms de SARM.

Le niveau de ROS a été étudié à l'aide d'une sonde DCFH-DA. Après irradiation NIR, les niveaux de ROS sont beaucoup plus élevés dans Ti-PDA @ SNP ou Ti-PDA @ SNP-OGP, par rapport à Ti ou Ti-PDA (P <0, 01; Fig. 2d). En comparaison, tous les groupes avaient des niveaux de ROS similaires en l'absence d'irradiation NIR (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3f). Sans irradiation NIR, l'intensité FL relative de Ti-PDA, Ti-PDA @ SNP et Ti-PDA @ SNP-OGP n'a pas été évidemment augmentée par rapport au groupe Ti. Sous irradiation laser, les intensités FL relatives de Ti-PDA @ SNP et Ti-PDA @ SNP-OGP ont été significativement améliorées, ce qui était similaire au contrôle positif (P <0, 01, Fig. 2e). Comparé à Ti, Ti-PDA@SNP-OGP présentait une baisse plus prononcée de l'intensité de l'ATP (~ 63, 5%) (Fig. 2f) et une étendue plus exhaustive de la fuite de BCA (~ 2, 6 fois) après irradiation NIR (Fichier supplémentaire 1: Fig. S3g). En revanche, il n'y avait qu'une diminution de 30, 5% de l'intensité de l'ATP (Fig. 2f) et une augmentation de 1, 75 fois de la fuite de BCA dans le Ti-PDA irradié par NIR (Fichier supplémentaire 1: Fig. S3g). L'hydrolyse de l'ONPG a été utilisée pour examiner l'étendue des dommages à la membrane bactérienne (c'est-à-dire que l'étendue de l'hydrolyse de l'ONPG augmente lorsque les membranes bactériennes sont altérées). Sans irradiation NIR, les différences dans l'étendue de l'hydrolyse de l'ONPG dans Ti-PDA, Ti-PDA@SNP et Ti-PDA@SNP-OGP étaient négligeables par rapport à Ti. Après irradiation NIR, l'étendue de l'hydrolyse de l'ONPG dans Ti-PDA @ SNP ou Ti-PDA @ SNP-OGP était significativement plus élevée que celle dans Ti ou Ti-PDA ( P <0, 01, Fig. 2g). De plus, l'activité déshydrogénase de la chaîne respiratoire a été mesurée après différents traitements. La déshydrogénase de la chaîne respiratoire a été inactivée dans Ti-PDA@SNP ou Ti-PDA@SNP-OGP après irradiation NIR (P < 0,01, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3h). Les altérations de la perméabilité de la membrane bactérienne sont généralement associées à la fuite de composants intracellulaires tels que l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou l'acide ribonucléique (ARN). Les biofilms de SARM dans Ti-PDA @ SNP-OGP ont démontré une concentration remarquablement élevée de la fuite de composants intracellulaires après irradiation NIR (P <0, 05 ou P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S3i), ce qui est cohérent avec le résultat de l'hydrolyse ONPG. Ensemble, ces résultats indiquent que le stress oxydatif médié par les ROS, la destruction de l'intégrité de la membrane bactérienne et la fuite de composants intracellulaires étaient les principaux facteurs de mort bactérienne et d'éradication des biofilms de SARM induits par Ti-PDA@SNP-OGP.

La morphologie et la zone de propagation des MSC ont été évaluées à l'aide d'une coloration fluorescente. Comme le montre la figure 3a, les MSC cultivées sur un substrat de Ti ou de Ti fonctionnalisé présentaient une morphologie en forme de fuseau. Plus de pseudopodes ont été identifiés à partir de MSC cultivées sur Ti-PDA@SNP-OGP. L'analyse quantitative a indiqué que la zone de propagation des MSC était plus grande sur Ti-PDA @ SNP-OGP, par rapport aux autres groupes (P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S4a). La viabilité cellulaire des MSC a été évaluée à l'aide du test CCK-8 après culture pendant 1, 4 et 7 jours. Par rapport aux cellules cultivées sur Ti, Ti-PDA et Ti-PDA @ SNP, la viabilité cellulaire des MSC cultivées sur Ti-PDA @ SNP-OGP était significativement plus élevée (P <0, 05 ou P <0, 01, Fig. 3b). Après irradiation NIR pendant 10 min, la viabilité cellulaire des MSC dans Ti a été réduite à 85, 4%, ce qui était supérieur à ceux de Ti-PDA (68, 9%), Ti-PDA @ SNP (53, 2%) et Ti-PDA @ SNP-OGP (58, 8%), respectivement ( P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S4b). Pendant ce temps, les viabilités cellulaires dans Ti-PDA @ SNP et Ti-PDA @ SNP-OGP étaient significativement inférieures à celles de Ti-PDA (P <0, 05, fichier supplémentaire 1: Fig. S4b). Ensuite, les cellules ont été cultivées davantage dans des conditions normales et il a été constaté que la viabilité cellulaire des MSC était significativement réduite sur Ti-PDA @ SNP-OGP par rapport à celle sur Ti après 1 jour (P <0, 01). Aucune différence statistiquement significative n'a été identifiée au jour 4 entre les groupes Ti et Ti-PDA@SNP-OGP (P > 0,05), alors qu'une différence significative a été trouvée au jour 7 (P < 0,01, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4c). La viabilité cellulaire (déterminée à l'aide du test LDH) des MSC cultivées sur Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR se rapprochait de celle du groupe témoin positif (MSC cultivées sur Ti sans MSRA). Cependant, après irradiation NIR, les viabilités cellulaires dans Ti, Ti-PDA et Ti-PDA @ SNP étaient significativement inférieures à celles de Ti-PDA @ SNP-OGP ( P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S4d). Après l'élimination du biofilm, nous avons effectué la coloration fluorescente et le test d'activité ALP pour évaluer le potentiel ostéogénique de Ti-PDA @ SNP-OGP. Ti-PDA@SNP-OGP (vierge) sans irradiation NIR a été utilisé comme contrôle. Les MSC cultivées sur Ti-PDA@SNP-OGP (utilisé) et Ti-PDA@SNP-OGP (vierge) présentaient des morphologies normales similaires et aucune différence évidente n'a été trouvée, reflétant indirectement que Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR pourrait éradiquer efficacement les biofilms de SARM mais n'affecterait pas la fonction biologique des MSC (fichier supplémentaire 1 : Fig. S4e). De plus, l'activité ALP des MSC dans Ti-PDA @ SNP-OGP (après l'éradication des biofilms de SARM) était significativement plus élevée (P <0, 05) que celle de Ti (Fichier supplémentaire 1: Fig. S4f).

Évaluation de la prolifération cellulaire et de l'ostéogenèse des CSM sur substrat Ti ou Ti fonctionnalisé. a Images de fluorescence de MSC sur substrat Ti ou Ti fonctionnalisé, Hoechst 33258 (bleu) et Actine (rouge). Barre d'échelle = 200 μm. b Prolifération cellulaire des MSC sur Ti ou substrat Ti fonctionnalisé par dosage CCK-8. c Activité ALP des MSC sur Ti ou substrat Ti fonctionnalisé après incubation pendant 7 jours. d La sécrétion de collagène des MSC sur du Ti ou un substrat de Ti fonctionnalisé a été détectée et quantifiée par coloration au rouge Sirius. La minéralisation ECM des MSC dans chaque échantillon a été mesurée et quantifiée par coloration au rouge Alizarine. f Expression de l'ARNm des gènes liés à l'ostéogenèse Runx2, BMP2, OPN et OCN mesurée par qRT‑PCR. *P < 0,05, **P < 0,01 ; Titane Ti, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique OGP, cellules stromales médullaires MSC, phosphatase alcaline ALP, matrice extracellulaire ECM, facteur de transcription 2 lié à Runt Runx2, protéine morphogénétique osseuse 2 BMP2, ostéopontine OPN, ostéocalcine OCN, qRT-PCR transcription inverse quantitative en temps réel-amplification en chaîne par polymérase

Après culture pendant 7 jours, les MSC cultivées sur Ti-PDA @ SNP-OGP présentaient une activité ALP plus élevée que celles des autres groupes (P <0, 01, Fig. 3c). Une tendance similaire a été observée pour la sécrétion de collagène et la minéralisation de l'ECM (Fig. 3d, e). La qRT-PCR a été utilisée pour étudier les profils d'expression de l'ARNm des gènes liés à l'ostéogenèse [Runt-related transcription factor 2 (Runx2), bone morphogenetic protein 2 (BMP2), ostéopontine (OPN), ostéocalcine (OCN)] dans les MSC, et les niveaux d'expression de Runx2, BMP2, OPN et OCN se sont avérés remarquablement plus élevés dans Ti-PDA@SNP-OGP que dans les autres groupes (P < 0 .05 ou P < 0.01, figure 3f).

La morphologie des cellules RAW264.7 cultivées sur substrat Ti ou Ti fonctionnalisé a d'abord été observée par coloration fluorescente. Plus de pseudopodes (indiqués par des cercles blancs avec des lignes pointillées) ont été observés dans les cellules RAW264.7 cultivées sur Ti-PDA @ SNP-OGP, par rapport à celles cultivées sur Ti, Ti-PDA ou Ti-PDA @ SNP (Fig. 4a). Les images SEM ont montré que, par rapport aux autres groupes, davantage de cellules RAW264.7 adhéraient au substrat Ti-PDA @ SNP-OGP (Fig. 4b). De plus, la polarisation des macrophages a également été évaluée par qRT-PCR. Comme le montre la figure 4d, les gènes marqueurs M1 (CD86, iNOS et CD11C) ont affiché une tendance à la baisse significative par Ti-PDA @ SNP-OGP par rapport aux autres groupes (P <0, 05 ou P <0, 01), suggérant son activité anti-inflammatoire. En comparaison, les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes marqueurs M2 (CD206, Arg-1 et CD163) étaient significativement régulés positivement par Ti-PDA@SNP-OGP par rapport à Ti, Ti-PDA ou Ti-PDA@SNP (P < 0,01).

Effets du Ti ou du substrat Ti fonctionnalisé sur la reprogrammation du phénotype des macrophages et la capacité anti-inflammatoire in vitro. a Coloration cytosquelette de cellules RAW 264.7 sur substrat Ti ou Ti fonctionnalisé après 24 h de culture, Hoechst 33258 (bleu) et Actine (rouge). Barre d'échelle = 50 μm. Les cercles en pointillés blancs représentent le pseudopode. b Images de microscopie électronique à balayage (MEB) de cellules RAW264.7 sur substrat Ti ou Ti fonctionnalisé après culture pendant 24 h. Barre d'échelle = 5 μm. c Viabilité cellulaire des cellules RAW264.7 sur divers échantillons après culture pendant 1, 3 et 5 jours. d Expression de l'ARNm des gènes marqueurs M1 CD86, iNOS et CD11C et des gènes marqueurs M2 CD206, Arg-1 et CD163 dans des cellules RAW264.7 stimulées par des lipopolysaccharides (LPS). e Expression de l'ARNm des gènes Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β dans les cellules RAW264.7. f Expression de l'ARNm des gènes pro-inflammatoires IL-1β et TNF-α et des gènes anti-inflammatoires IL-1ra et IL-10 dans les cellules RAW264.7 stimulées par le LPS. *P < 0,05, **P < 0,01 ; Titane Ti, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique OGP, grappe de différenciation CD86 86, synthase d'oxyde nitrique inductible iNOS, grappe de différenciation CD11C 11C, grappe de différenciation CD206 206, Arg-1 arginase-1, grappe de différenciation CD163 163, Runx2 runt-related transcription factor 2, BMP2 bone morph protéine génétique 2, facteur de croissance endothélial vasculaire VEGF, facteur de croissance transformant-β TGF-β, IL-1β interleukine-1β, TNF-α facteur de nécrose tumorale-α, IL-1ra interleukine-1ra, IL-10 interleukine-10

Les niveaux d'expression de l'ARNm de Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β ont été étudiés plus en détail dans les cellules RAW264.7. Par rapport à Ti, les niveaux d'expression d'ARNm de Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β dans Ti-PDA @ SNP-OGP ont augmenté jusqu'à 1, 8, 2, 5, 3, 1 et 2, 7 fois, respectivement ( P <0, 01, Fig. 4e). Le potentiel anti-inflammatoire de Ti-PDA@SNP-OGP a également été évalué. Comparés à d'autres groupes, les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes pro-inflammatoires IL-1β et TNF-α étaient régulés à la baisse dans Ti-PDA @ SNP-OGP, alors qu'ils présentaient la tendance opposée avec une expression plus élevée de l'ARNm des gènes anti-inflammatoires IL-1ra et IL-10 (P <0, 01, Fig. 4f). Ensemble, ces résultats mettent en évidence l'effet de promotion de Ti-PDA@SNP-OGP pour inverser le microenvironnement pro-inflammatoire défavorable et reprogrammer les macrophages en phénotype M2, créant ainsi un microenvironnement pro-régénératif.

Le potentiel de différenciation ostéogénique des MSC et l'expression de facteurs inflammatoires par les cellules RAW264.7 après irradiation NIR ont été évalués. Aucune différence statistiquement significative n'a été trouvée entre Ti-PDA @ SNP-OGP et Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR ( P > 0, 05), alors que la minéralisation des MSC dans Ti-PDA @ SNP-OGP était plus élevée que les autres groupes après irradiation NIR ( P < 0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S4g). De plus, après irradiation NIR pendant 10 min, le niveau d'expression de l'ARNm du marqueur M1 CD86 dans Ti-PDA@SNP-OGP dans les cellules RAW264.7 était significativement inférieur à celui des autres groupes (P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S4h). De plus, aucune différence statistiquement significative dans le niveau d'expression de CD86 entre Ti-PDA@SNP-OGP et Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR (P > 0,05). Une tendance opposée a été observée pour l'expression du marqueur M2 CD206 dans les cellules RAW264.7 (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4h). Après l'élimination du biofilm, l'interaction des MSC avec le Ti-PDA @ SNP-OGP utilisé a été étudiée in vitro à l'aide de tests d'activité CCK-8 et ALP. Les MSC sur Ti-PDA@SNP-OGP utilisés pour la première ou la deuxième fois présentaient une viabilité cellulaire significativement plus élevée que ceux sur Ti ou Ti-PDA@SNP-OGP utilisés trois fois (P < 0,05 ou P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S4i). De même, les activités ALP des MSC sur Ti-PDA@SNP-OGP utilisées pour la première ou la deuxième fois étaient supérieures à celles sur Ti ou Ti-PDA@SNP-OGP utilisées trois fois après incubation pendant 7 jours (P < 0,05, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S4j). Collectivement, les résultats indiquent que l'hyperthermie et la libération de NO déclenchée par photothermie par Ti-PDA @ SNP-OGP peuvent être répétées deux fois pour éradiquer les biofilms établis et améliorer la différenciation ostéogénique des MSC après l'éradication du biofilm.

Les cellules RAW264.7 exposées à Ti-PDA @ SNP-OGP se sont avérées avoir des expressions d'ARNm et de protéines significativement améliorées de Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β (P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S5a, b). En outre, un système de co-culture Transwell a été utilisé pour évaluer davantage l'effet ostéogénique de promotion in vitro des cellules RAW264.7 induites par Ti-PDA @ SNP-OGP sur les MSC. Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées sur différents substrats dans la chambre inférieure et les MSC ont été cultivées dans la chambre supérieure (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5c). Après co-culture pendant 1 jour, davantage de MSC migrés ont été trouvés dans Ti-PDA@SNP-OGP (fichier supplémentaire 1 : Fig. S5d), qui présentait la migration transmembranaire la plus élevée parmi tous les groupes (P < 0,05 ou P < 0,01). L'analyse quantitative a montré que l'activité ALP, les niveaux de sécrétion de collagène et la minéralisation ECM des MSC étaient significativement plus élevés dans Ti-PDA@SNP-OGP que dans les autres groupes (P < 0,01). De même, de plus grandes zones colorées au rouge Sirius de fibres de collagène et des zones colorées au rouge Alizarine de dépôts de calcium ont été trouvées dans Ti-PDA@SNP-OGP (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S5e). De plus, les niveaux d'expression des gènes liés à l'ostéogenèse Runx2, BMP2, ALP, OPN et OCN étaient les plus élevés dans le groupe Ti-PDA @ SNP-OGP (P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S5f).

Pour vérifier les résultats in vitro, un modèle d'implantation de défaut fémoral infecté par le SARM a été établi avec succès (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6a). Les images SEM ont montré que Ti-PDA@SNP-OGP n'a pas été endommagé lors de l'implantation (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6b). Avant l'implantation, les tiges Ti et Ti-PDA @ SNP-OGP ont été incubées avec des biofilms de SARM pendant 2 jours. La formation de biofilms de SARM sur les implants a été examinée au MEB. Il a été constaté que tous les implants étaient recouverts de biofilms de SARM après incubation avec une suspension de SARM pendant 2 jours (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6c). Le SARM adhérent sur tous les implants a été exfolié par l'énergie ultrasonique. L'analyse quantitative a indiqué que le SARM pouvait être trouvé dans Ti (2,71 × 107 UFC), Ti-PDA (2,60 × 107 UFC), Ti-PDA@SNP (2,46 × 107 UFC) et Ti-PDA@SNP-OGP (2,66 × 107 UFC).

Un jour après l'implantation, les sites d'implantation de l'implant Ti ou Ti-PDA@SNP-OGP ont été exposés à une irradiation laser à 808 nm. Les images photothermiques et les changements de température correspondants ont été enregistrés (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6d). Après irradiation pendant 10 min, le changement de température (∆T) de l'implant Ti-PDA@SNP-OGP était de 23,7 °C, ce qui était significativement plus élevé que celui de l'implant Ti (12,1 °C, P < 0,01, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6e). Après implantation pendant 3 jours, les deux implants ont été délicatement retirés et trempés dans du MHB pendant 12 heures. Après incubation à l'obscurité, le milieu MHB contenant l'implant Ti ou Ti-PDA@SNP-OGP était féculent. Ceci est révélateur des capacités antibactériennes insuffisantes de Ti et Ti-PDA@SNP-OGP sans irradiation NIR. Après irradiation NIR, le milieu MHB contenant l'implant Ti-PDA@SNP-OGP est devenu clair, tandis que le milieu MHB contenant l'implant Ti est resté féculent (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S6f). L'analyse quantitative des plaques étalées a montré que seulement 6,2 % des biofilms de SARM ont été éliminés sans irradiation NIR. En revanche, plus de 95,7 % des biofilms de SARM sur l'implant Ti-PDA@SNP-OGP ont été éradiqués après irradiation NIR (P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S6g). La spectroscopie d'émission atomique plasma à couplage inductif (ICP-AES) a été utilisée pour étudier la teneur en ions Fe dans la moelle fémorale intraluminale afin de déterminer la dégradation in vivo de Ti-PDA @ SNP-OGP à des moments prédéterminés (0, 5, 1, 3, 7, 14 et 28 j). Le pourcentage d'ions Fe accumulés dans la moelle fémorale intraluminale était de 7,54 % dans Ti-PDA@SNP-OGP à 28 jours. Notamment, la demi-vie de l'OGP dans le substrat Ti-PDA @ SNP-OGP in vivo était d'environ 7 jours. En revanche, la quantité cumulée d'ions Fe dans Ti n'était que de 0,9 % (P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S6h). Collectivement, l'évaluation microbiologique a démontré que l'implant Ti-PDA@SNP-OGP présentait un effet combiné photothermique et antibactérien NO et d'éradication du biofilm SARM in vivo.

Pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire, un ELISA a été réalisé pour quantifier la concentration en cytokines excrétives pro-inflammatoires (TNF-α et IL-6) et anti-inflammatoires (TGF-β et IL-10). Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR présentait les niveaux d'expression protéique les plus faibles de TNF-α et d'IL-6 (P <0, 01, fichier supplémentaire 1: Fig. S6i). Les teneurs en TNF-α et IL-6 étaient significativement plus élevées dans Ti-PDA@SNP-OGP que celles dans Ti-PDA@SNP-OGP irradiées par NIR, alors qu'elles montraient une tendance opposée avec des teneurs plus élevées en cytokines anti-inflammatoires TGF-β et IL-10 sécrétées par ce dernier (P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S6i), qui a été attribuée à la génération de NO déclenchée par la photothermie.

Les colorations HE et Giemsa ont été utilisées pour analyser la réponse inflammatoire 3 jours après l'implantation in vivo. Seules quelques cellules inflammatoires (indiquées par des flèches rouges) et des bactéries résiduelles (indiquées par des flèches rouges) ont été identifiées dans Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR, ce qui a été confirmé par des résultats quantitatifs (P < 0,05 ou P < 0,01, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7a). À l'inverse, une infiltration abondante de cellules inflammatoires et de nombreuses cellules MRSA a été observée dans d'autres groupes (P < 0,01, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7b).

À l'interface os-implant, une coloration IHC des macrophages M1 avec CD86 et des macrophages M2 avec CD206 a été réalisée (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7c). Dans Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR, la distribution des macrophages positifs pour CD86 a présenté une diminution remarquable, alors qu'ils affichaient une tendance principalement plus forte de macrophages positifs pour CD206. Ensemble, ces résultats démontrent le potentiel de l'implant à médier la reprogrammation anti-inflammatoire et phénotypique des macrophages, conformément aux résultats in vitro.

Comme le montre la figure 5a, une nouvelle formation osseuse a été observée dans le groupe Ti-PDA @ SNP-OGP qui avait été soumis à une irradiation NIR. Les pourcentages de volume osseux nouveau sur le volume osseux total (BV/TV), l'épaisseur de la plaque trabéculaire (Tb.Th), le nombre trabéculaire (Tb.N) et la séparation trabéculaire (Tb.Sp) ont été étudiés et calculés. Les pourcentages les plus élevés de BV/TV, Tb.Th et Tb.N et le pourcentage le plus faible de Tb.Sp ont été trouvés dans Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR (Fig. 5b, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7d). Comme le montre la figure 5c, une formation abondante de nouveau tissu osseux a été observée à la surface du Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR, tandis que seule une petite quantité d'os nouveau a été trouvée dans Ti, Ti irradié par NIR ou Ti-PDA @ SNP-OGP après 4 semaines de traitement. Des résultats similaires ont été obtenus pour la coloration au trichrome de Masson. Le Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR présentait le pourcentage le plus élevé de nouvelle zone osseuse (37,5 %) et de contact os-implant (34,3 %) (P < 0,05 ou P < 0,01, fichier supplémentaire 1 : Fig. S7e), conformément aux résultats du micro-CT. Une évaluation plus approfondie des protéines liées à la formation osseuse (ALP et OPN) autour des tissus osseux péri-implantaires avec coloration IHC a identifié des zones plus colorées positivement d'ALP et d'OPN dans Ti-PDA@SNP-OGP. Par rapport au Ti, au Ti irradié par NIR et au Ti-PDA@SNP-OGP, le Ti-PDA@SNP-OGP irradié par NIR a montré une expression de CD31 (marqueur de vascularisation) significativement améliorée autour des implants (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S7f).

Régénération osseuse dans un modèle d'implantation de défaut fémoral infecté par le SARM in vivo. a Images micro-CT du nouvel os. Barre d'échelle = 400 μm. b Analyse quantitative des tissus osseux nouvellement formés basée sur des images de reconstruction tridimensionnelles (3D) de micro-CT, y compris le volume osseux/volume total (BV/TV), l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th) et le nombre trabéculaire (Tb.N) après 4 semaines. c Images représentatives de HE et de la coloration trichrome de Masson à l'interface os-implant. Barre d'échelle = 200 μm. **P < 0,01 ; Titane Ti, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique OGP, hématoxyline HE et éosine

La biosécurité de la température douce (~ 51 ° C) induite par le PTT de Ti-PDA @ SNP-OGP in vivo a été évaluée à l'aide d'une analyse biochimique du sang total, y compris les globules blancs (WBC), les granulocytes neutrophiles (NEUT), les globules rouges (RBC), l'hémoglobine (HGB), l'hématocrite (HCT) et les plaquettes (PLT). Aucune différence statistiquement significative n'a été trouvée entre le Ti et le Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par le NIR pour les indicateurs WBC, NEUT, RBC, HGB, HCT et PLT (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S8). Ces résultats indiquent qu'il n'y avait aucun risque évident associé à la thérapie Ti-PDA@SNP-OGP et NIR à l'intérieur du corps.

Dans cette étude, des nanoparticules de PDA ont été encapsulées avec du SNP sensible à la photothermie et modifiées à l'aide d'OGP, et un revêtement de dopamine a été formé sur Ti pour charger des nanoparticules PDA @ SNP-OGP et construire Ti-PDA @ SNP-OGP (Fig. 6). En tant que facteur ostéogénique, l'OGP a été largement utilisé pour augmenter le potentiel de différenciation ostéogénique des matériaux de réparation osseuse en améliorant la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée ostéoblastique in vivo. Dans nos études précédentes, l'OGP a été identifié comme étant un facteur ostéo-immunomodulateur efficace pour améliorer la capacité anti-inflammatoire des cellules RAW264.7 et augmenter l'effet ostéogénique des MSC [41, 42, 43]. Bai et al. [44] ont fabriqué un OGP modifié contenant du catéchol tétravalent (DOPA) 4 avec une adhérence des moules et des fonctions ostéo-immunomodulatrices pour une ostéointégration avancée via la suppression des réponses inflammatoires et la régulation positive du phénotype M2 des macrophages. Cependant, la faible capacité antibactérienne a rendu les implants en Ti modifiés par l'OGP extrêmement limités en clinique [44,45,46]. De nombreuses études se sont concentrées uniquement sur la fonctionnalisation des implants Ti modifiés par l'OGP, tels que la fonction unique (capacité antibactérienne ou ostéointégration améliorée) ou la double fonction (y compris la capacité antibactérienne et l'ostéointégration améliorée). Cependant, ces approches n'améliorent pas l'ostéointégration de l'implant en présence de multiples comorbidités (par exemple, infection bactérienne, inflammation). L'émergence de SARM et de ses biofilms sur les surfaces des implants en Ti aggrave la situation, entraînant ainsi l'échec des implants en Ti [47]. Pour cette raison, nous avons conçu un revêtement multifonctionnel sur Ti qui pourrait réguler la diaphonie entre les cellules RAW264.7 et les MSC pour améliorer l'ostéointégration et fournir des capacités antibactériennes et d'élimination du biofilm en utilisant l'irradiation NIR.

Diagrammes schématiques montrant que Ti-PDA@SNP-OGP élimine les biofilms MSRA via le NO déclenché par photothermie et l'immunothérapie pour une meilleure ostéointégration. Titane Ti, nanoparticules de polydopamine PDA, nitroprussiate de sodium SNP, peptide de croissance ostéogénique OGP, NO monoxyde d'azote, facteur de croissance endothélial vasculaire VEGF, facteur de croissance transformant TGF-β-β, IL-10 interleukine-10, TNF-α facteur de nécrose tumorale-α

En raison de l'excellent effet photothermique du PDA, l'hyperthermie localisée induite par l'énergie lumineuse irradiée par laser pour l'élimination des biofilms établis a été largement utilisée [21, 23]. L'augmentation de température par un agent photothermique est liée à des facteurs tels que sa concentration, la densité laser, le temps d'irradiation laser et la température ambiante [20, 21]. Cependant, les biofilms ne sont éradiqués que par l'application d'une irradiation NIR à 70 °C. Une telle température réduit inévitablement la viabilité de la cellule hôte en induisant l'apoptose ou la nécrose [48]. En revanche, la température douce (~ 52 ° C) induite par le PTT entraîne moins d'effets indésirables, mais les capacités antibactériennes et d'éradication du biofilm sont également considérablement réduites à cette température douce [23]. Dans cette étude, Ti-PDA@SNP-OGP a converti l'énergie lumineuse irradiée par laser en hyperthermie localisée. L'augmentation de la température des tissus, à son tour, a déclenché la libération de NO du SNP de manière "à la demande" en raison de la destruction de l'empilement π-π et/ou de l'adsorption physique entre les nanoparticules de SNP et de PDA [40]. Pour minimiser les effets indésirables, 0, 5 mg / ml de nanoparticules PDA @ SNP-OGP avec une intensité laser de 1, 0 W / cm2 pendant 10 min ont été utilisées pour étudier l'effet photothermique et la température a atteint environ 52 ° C. L'hyperthermie recueillie par Ti-PDA@SNP-OGP pourrait détruire la membrane bactérienne et provoquer par la suite la fuite de protéines de SARM, entraînant la capacité antibactérienne souhaitable. Ces résultats sont cohérents avec des études antérieures [49, 50]. La libération de NO peut améliorer l'effet antibactérien en provoquant des stress nitrosatifs et oxydatifs et en brisant le métabolisme bactérien de l'azote [51, 52]. Sur la base de ces résultats, la libération contrôlable et rapide de NO via l'irradiation NIR est un arsenal utile pour l'élimination des biofilms en peu de temps et ne nécessite pas de températures exorbitantes.

Les implants idéaux doivent présenter une excellente cytocompatibilité pour réguler les fonctions fondamentales des cellules liées à l'ostéogenèse [53, 54]. La viabilité cellulaire, l'activité ALP, la sécrétion de collagène et la minéralisation de l'ECM sont considérablement améliorées par Ti-PDA@SNP-OGP. Dans cette étude, les gènes liés à l'ostéogenèse Runx2, BMP2, OPN et OCN étaient significativement régulés positivement dans Ti-PDA@SNP-OGP par rapport aux autres groupes. Ces résultats indiquent que Ti-PDA@SNP-OGP a le potentiel d'améliorer la différenciation ostéogénique des CSM [42, 43].

Une fois que l'implant a été intégré dans les tissus osseux, les cellules immunitaires telles que les macrophages sont recrutées sur le site de l'implant en quelques heures ; ces cellules immunitaires génèrent une cascade d'événements qui conduisent à la réponse inflammatoire précoce [55, 56, 57, 58, 59]. Une réponse inflammatoire est bénéfique pour améliorer la cicatrisation osseuse car les CSM osseuses sont recrutées et l'angiogenèse est stimulée [60,61,62]. Au stade tardif de l'inflammation, les macrophages M1 se polariseront dans le phénotype M2 pour atténuer l'inflammation et sécréteront des cytokines anti-inflammatoires pour faciliter la régénération osseuse [63,64,65,66,67]. Néanmoins, les macrophages multifonctionnels ne sont pas capables de subir une transition phénotypique dans des conditions pathologiques [59]. Une inflammation persistante et sévère entraîne des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires dans les tissus osseux environnants. Ces cytokines pro-inflammatoires augmentent l'activité des ostéoclastes et diminuent le recrutement ou la migration des CSM. Il en résulte une déconnexion osseuse et une mauvaise ostéointégration [68,69,70,71,72]. Dans cette étude, Ti-PDA @ SNP-OGP a significativement régulé à la baisse les niveaux d'expression d'ARNm des marqueurs M1 CD86, iNOS et CD11C et régulé à la hausse les niveaux d'expression d'ARNm des marqueurs M2 CD206, Arg-1 et CD163. En outre, les niveaux d'expression de l'ARNm des gènes Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β ont été significativement régulés à la hausse par Ti-PDA @ SNP-OGP. De plus, par rapport à d'autres groupes, Ti-PDA@SNP-OGP a également inhibé les niveaux d'expression de l'ARNm des cytokines pro-inflammatoires IL-1β et TNF-α et a amélioré l'expression des cytokines anti-inflammatoires IL-1ra et IL-10. Cela pourrait être dû à l'effet ostéo-immunomodulateur de Ti-PDA@SNP-OGP [42, 46].

La diaphonie entre les MSC et les cellules RAW264.7 joue un rôle vital dans l'amélioration de l'ostéointégration de l'implant [72,73,74]. Par conséquent, l'effet d'induction ostéogénique des cellules RAW264.7 sur les MSC lors de la stimulation de Ti-PDA @ SNP-OGP doit être soigneusement pris en compte. Les expressions d'ARNm et de protéines de Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β dans les cellules RAW264.7 étaient régulées à la hausse, ce qui pourrait être attribué à l'immobilisation de l'OGP sur Ti pour stimuler les cellules RAW264.7 à sécréter des médiateurs ostéogéniques [44, 46]. Les MSC dans Ti-PDA @ SNP-OGP ont présenté la migration transmembranaire la plus élevée parmi tous les groupes après co-culture avec des cellules RAW264.7. De plus, l'activité ALP, la sécrétion de collagène et la minéralisation de l'ECM dans Ti-PDA@SNP-OGP étaient supérieures à celles de Ti, Ti-PDA ou Ti-PDA@SNP. De plus, il a été prouvé que Ti-PDA@SNP-OGP stimule l'expression des gènes liés à l'ostéogenèse Runx2, BMP2, ALP, OPN et OCN dans les CSM. Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons suggéré que Ti-PDA @ SNP-OGP est un immunomodulateur osseux potentiellement efficace qui améliore la libération de médiateurs anti-inflammatoires par les cellules RAW264.7 pour améliorer la migration et la différenciation des MSC via plusieurs signalisations paracrine de Runx2, BMP2, VEGF et TGF-β.

Pour l'évaluation des capacités antibactériennes et anti-inflammatoires in vivo, plus de 95,7 % des biofilms de SARM sur les implants Ti-PDA@SNP-OGP ont été éradiqués après irradiation NIR. En outre, seules quelques cellules inflammatoires et bactéries résiduelles ont été observées dans Ti-PDA@SNP-OGP après irradiation NIR, en raison des effets synergiques d'une légère hyperthermie et de la libération de NO déclenchée par la photothermie sur l'élimination du biofilm de SARM [17, 23]. Les mécanismes antibactériens potentiels pour notre Ti-PDA @ SNP-OGP ont été élaborés ci-dessous. Premièrement, l'hyperthermie rend les bactéries plus sensibles à l'environnement extérieur et peut par la suite endommager efficacement la membrane bactérienne, qui peut jouer un rôle dominant dans le processus d'élimination du biofilm SARM. Deuxièmement, le NO déclenché par la photothermie pourrait briser le métabolisme de l'azote, induire des stress nitrosatifs/oxydatifs et entraîner la mort du SARM. Troisièmement, l'immunothérapie peut améliorer la défense de l'hôte contre les bactéries invasives et renforcer la propriété antibactérienne contre les bactéries résiduelles [75]. En outre, Ti-PDA @ SNP-OGP possède une meilleure capacité à supprimer les réponses inflammatoires via la régulation à la baisse des cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-6 et la régulation à la hausse des cytokines anti-inflammatoires TGF-β et IL-10. L'amélioration de la réponse anti-inflammatoire pourrait être attribuée à l'excellente activité antibactérienne du Ti-PDA@SNP-OGP irradié par le NIR et à l'effet immunomodulateur de l'OGP [42]. Les résultats in vivo de l'ICP-AES ont suggéré que Ti-PDA@SNP-OGP était principalement distribué dans la cavité médullaire des fémurs. Le revêtement Ti-PDA @ SNP-OGP s'est rapidement dégradé au cours des 7 premiers jours, suivi d'une dégradation déclinée au cours des 21 jours suivants. Ces résultats ont démontré que Ti-PDA@SNP-OGP possédait des caractéristiques de dégradation soutenue. Une telle caractéristique est bénéfique pour une meilleure ostéointégration.

La micro-CT a confirmé que les pourcentages les plus élevés de BV/TV, Tb.Th et Tb.N et le pourcentage le plus faible de Tb.Sp ont été trouvés dans Ti-PDA@SNP-OGP. La coloration IHC des protéines liées à la formation osseuse ALP, OPN et CD31 a suggéré que Ti-PDA @ SNP-OGP irradié par NIR présentait une meilleure ostéogenèse par rapport aux autres groupes, comme le montre l'expression plus élevée d'ALP, OPN et OCN. Collectivement, une excellente ostéointégration a été obtenue simultanément grâce à l'effet ostéo-immunomodulateur de Ti-PDA@SNP-OGP.

Plusieurs limites doivent encore être abordées. L'effet photothermique sur les fonctions physiologiques des MSC et des cellules RAW264.7 devrait être exploré plus avant. La question de savoir si les propriétés bioactives de l'OGP après irradiation NIR pourraient être inactivées et la libération in vivo de NO dans un modèle d'implantation de fémur infecté devrait être étudiée de manière approfondie. Le NO est une molécule inflammatoire, donc la rétroaction du NO aux macrophages et ses influences négatives potentielles sur les tissus environnants doivent être étudiées plus avant. En termes de comportements cellulaires, il présente des propriétés dynamiques, couplées et régulées spatio-temporellement, mais les fonctions physiologiques des MSC et des macrophages n'étaient pas contrôlées précisément par nos implants Ti fabriqués en réponse à des signaux spatio-temporels. Par conséquent, la fabrication d'implants multifonctionnels en Ti permettant un contrôle précis des fonctions physiologiques des cellules MSC et RAW264.7 ainsi que d'excellentes propriétés antibactériennes et d'éradication du biofilm pourrait constituer une approche plus rationnelle pour une meilleure ostéointégration.

Dans cette étude, nous avons proposé pour la première fois une nouvelle interface multifonctionnelle activable par NIR avec un PTT doux potentialisé par le NO et un OGP ostéo-immunomodulateur sur des implants en Ti, basé sur une fonctionnalisation interfaciale médiée par PDA, pour l'éradication des biofilms de SARM et une ostéointégration améliorée. Nous avons démontré que Ti-PDA@SNP-OGP est une plate-forme idéale pour la libération contrôlée de NO. Plus précisément, NO a été chargé sur Ti-PDA@SNP-OGP via une interaction spéciale d'empilement π-π et/ou une adsorption physique entre la molécule SNP et le PDA. Ti-PDA @ SNP-OGP s'est avéré afficher un fort effet photothermique lors d'une irradiation laser à 808 nm, ce qui a fourni une condition de stimulation externe idéale pour la libération contrôlée de NO. En particulier, la libération de NO pourrait être contrôlée avec précision par une irradiation NIR intermittente, montrant un mode de commutation "marche-arrêt".

Lors de l'irradiation NIR, Ti-PDA @ SNP-OGP a affiché un effet photothermique synergique et antibactérien NO en inhibant de manière significative la croissance du SARM. De plus, les biofilms formés par le SARM ont été efficacement éliminés par le traitement combiné photothermique et NO. Le mécanisme antibactérien a indiqué que les bactéries traitées avec Ti-PDA@SNP-OGP étaient stérilisées par le stress oxydatif médié par les ROS, la destruction de l'intégrité de la membrane bactérienne et la fuite du contenu bactérien. Des expériences in vitro ont révélé que Ti-PDA @ SNP-OGP facilitait non seulement la différenciation ostéogénique des MSC, mais supprimait également les macrophages M1, tandis que stimulait le phénotype M2 pro-guérison, remodelant ainsi le microenvironnement endommagé en un microenvironnement pro-régénératif, qui, à son tour, a facilité l'ostéogenèse et supprimé l'inflammation via la diaphonie des voies de signalisation multiples.

De plus, dans un modèle d'infection associée à l'implant chez le rat, Ti-PDA@SNP-OGP a éliminé les biofilms de SARM formés, atténué l'inflammation qui l'accompagne et médié l'ostéo-immunomodulation, résultant en une excellente ostéointégration. Il est à noter que les évaluations de biocompatibilité in vitro et in vivo ont suggéré que la thérapie Ti-PDA@SNP-OGP et NIR était sans danger pour les applications biomédicales. Pris ensemble, l'étude fournit une stratégie prometteuse pour la fabrication d'implants Ti multifonctionnels pour éradiquer les biofilms de SARM et améliorer l'ostéointégration.

Les données et les matériaux utilisés dans l'étude actuelle sont tous disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Phosphatase alcaline

Arginase-1

L'adénosine triphosphate

Infection associée aux biomatériaux

Acide bicinchoninique

Protéine morphogénétique osseuse 2

N,N′-disecbutyl-N,N′-dinitroso-p-phénylènediamine

Volume osseux sur volume osseux total

Kit de comptage cellulaire-8

Unité formant colonie

3,3ʹ-diaminobenzidine

Diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine

Milieu d'aigle modifié de Dulbecco

Matrice extracellulaire

Dosage immuno-enzymatique

Substances polymères extracellulaires

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

S-nitrosoglutathion

Hématocrite

Hémoglobine

Hématoxyline et éosine

Spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif

Immunohistochimie

Interleukine‑6

Interleukine‑10

Interleukine‑1β

Beaucoup de cohésion

Beaucoup d'adhérence

Lipopolysaccharide

L-arginine

Bouillon Mueller Hinton

Staphylococcus aureus résistant à la méticilline

Cellules stromales de la moelle

Granulocytes neutrophiles

Lumière proche infrarouge

L'oxyde nitrique

Diolates de diazénium

Ostéocalcine

Peptide de croissance ostéogénique

O-nitrophényl-β-d-galactopyranoside

Ostéopontine

Nanoparticules de polydopamine

Plaquettes

Thérapie photothermique

Transcription inverse quantitative en temps réel et réaction en chaîne par polymérase

des globules rouges

Les espèces réactives de l'oxygène

Facteur de transcription lié à Runt 2

La microscopie électronique à balayage

Nitroprussiate de sodium

Numéro trabéculaire

Séparation trabéculaire

Épaisseur de la plaque trabéculaire

Transformer le facteur de croissance-β

Titane

Facteur de nécrose tumorale-α

Facteur de croissance endothélial vasculaire

globules blancs

Angles de contact avec l'eau

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Les auteurs remercient tous les étudiants et techniciens du laboratoire pour leur coopération.

Ce travail a été soutenu financièrement par la National Natural Science Foundation of China (82101069, 82102537, 82160411, 82002278), la Natural Science Foundation of Chongqing Science and Technology Commission (CSTC2021JCYJ-MSXMX0170, CSTB2022BSXM-JCX0039), le First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Cultivating Fund (PY JJ2021-02), la Commission municipale des sciences et technologies de Pékin (Z221100007422130) et le Programme d'incubation des jeunes en sciences et technologies médicales de PLA (21QNPY116).

Yong-Lin Yu, Jun-Jie Wu et Chuan-Chuan Lin ont contribué à parts égales à ce travail

Département de pathologie, Hôpital affilié de l'Université médicale de Zunyi, Zunyi, 563003, Guizhou, Chine

Yong Lin Yu

Centre de recherche en laboratoire, premier hôpital affilié de l'Université médicale de Chongqing, Chongqing, 400016, Chine

Jun-Jie Wu et Bai-Long Tao

Département de transfusion sanguine, Laboratoire de radiobiologie, Deuxième hôpital affilié, Université de médecine militaire de l'armée, Chongqing, 400037, Chine

Chuan-Chuan Lin

Département d'endocrinologie de la reproduction, Centre de santé de Chongqing pour femmes et enfants, Chongqing, 401147, Chine

Xian Qin

The Graduate School, Université Augusta, Augusta, GA, 30912, États-Unis

Franklin R.Tay

Département de stomatologie, septième centre médical de l'hôpital général de l'APL, Pékin, 100700, Chine

Li Miao et Yang Jiao

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LM, BLT et YJ ont conçu l'idée de l'étude, conçu les expériences et interprété les données. YLY, JJW, CCL et XQ ont réalisé les expériences. LM, BLT et YJ ont rédigé le manuscrit. FRT, BLT et YJ ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Yong-Lin Yu, Li Miao, Bai-Long Tao ou Yang Jiao.

Toutes les expériences animales in vivo ont été menées conformément aux directives institutionnelles et aux réglementations pertinentes pour l'expérimentation animale des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Chongqing et du septième centre médical de l'hôpital général de l'APL, et approuvées par les comités d'éthique animale de l'Université médicale de Chongqing (2021-738) et le septième centre médical de l'hôpital général de l'APL (2021-110).

N'est pas applicable.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Amorces qRT-PCR pour les MSC et les cellules RAW 264.7 utilisées dans cette étude. Figure S1. Caractérisation de Ti-PDA@SNP-OGP. Figure S2. Caractérisation du substrat Ti-PDA@SNP-OGP. Figure S3. Mécanisme d'inhibition sur les biofilms de Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline. Figure S4. Évaluation de la biocompatibilité, de l'anti-inflammation et de la duplication de Ti ou d'un substrat de Ti fonctionnalisé. Figure S5. Ostéo-immunomodulation in vitro de Ti-PDA@SNP-OGP. Figure S6. Évaluation antibactérienne et anti-inflammatoire in vivo. Figure S7. Anti-inflammatoire, activité antibactérienne et régénération osseuse in vivo. Figure S8. Biosécurité de la température douce induite par le PTT de Ti-PDA@SNP-OGP in vivo.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La renonciation Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) s'applique aux données mises à disposition dans cet article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit aux données.

Réimpressions et autorisations

Yu, YL., Wu, JJ., Lin, CC. et coll. Élimination des biofilms de Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline sur les implants en titane via l'oxyde nitrique déclenché par photothermie et l'immunothérapie pour une meilleure ostéointégration. Military Med Res 10, 21 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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Reçu : 19 mai 2022

Accepté : 07 avril 2023

Publié: 04 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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